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第二单元第一章第一节三鹿“结石奶粉”事件与蛋白质检测技术

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第二单元第一章第一节

三鹿“结石奶粉”事件与蛋白质检测技术

滕州一中

引子——

事故一：2008年中秋节，本应该是祥和的节日气氛却笼罩上了沉重的阴影：国内奶制品行业的巨头，三鹿集团生产的部分三鹿牌婴幼儿奶粉，因含有人为添加的三聚氰胺，导致部分食用该奶粉者出现泌尿系统结石病例。截至9月15日早8时，临床诊断患儿已达1253名(其中2名已死亡)。

起因：据报是不法分子为提高原奶中的蛋白质含量而掺入三聚氰胺。

事故二：2007年3月起，中国江苏和山东两企业输往美国的宠物食品诱发大量猫狗死亡。之后调查显示，这两个企业部分出口的小麦蛋白粉和大米蛋白粉违规添加了三聚氰胺。事发后，中国相关产品短期内的出口在多个国家遭禁，“中国制造”受到质疑。

起因：不法厂商为提高产品中植物蛋白的含量而掺入三聚氰胺。

事故三：相信许多人对四年前发生在安徽阜阳的“大头娃娃”事件还记忆犹新：一百多名婴儿受害，十多名婴儿死亡，震惊全国。原因是是40多种不知名的劣质奶粉以低价在当地农村长期销售，其营养成分，尤其是蛋白质含量严重低下，结果造成婴儿发育迟缓和死亡事件。

起因：不法厂商追求暴利而推出的蛋白质等营养成分严重不足的“假奶粉”。

三次触目惊心的食品安全事故，起因都是不法厂商为了提高最终产品或原料中蛋白质的含量而进行掺假所引起的。

蛋白质是生物主要的组成部分，各种酶、细胞因子都属于蛋白质，蛋白质的重要性不言而喻。人体摄取蛋白质类营养，不光是数量，其种类、构成也非常重要。蛋白质的营养价值主要取决于被人体消化吸收的程度和该种蛋白质所含氨基酸的种类及组合。凡易于被人体消化、吸收和利用的蛋白质，其营养价值就高。

从消化的角度来看，动物蛋白质比植物蛋白质更易消化和吸收。从蛋白质的氨基酸组成种类上来看，人体蛋白质由20种氨基酸组成，其中12种氨基酸是人体可以通过自身生化反应合成的，被称为非必需氨基酸；还有８种氨基酸人体不能合成，必须从食物中摄取，被称为必需氨基酸。动物蛋白中，一般都含有人体必需的８种氨基酸，特别是蛋制品和乳制品，故一般来说动物蛋白营养价值比植物蛋白高。

正因为蛋白质有着如此重要的重要性及营养价值，蛋白质含量才成为食品检测中的重要指标。

目前蛋白质含量检测的国标规定方法是凯氏定氮法。

凯氏定氮法原理：由于蛋白质是含氮的有机化合物，蛋白质平均含氮量约16%，经典的凯氏定氮法检测的原理其实是检测食品中氮的总含量。其基本过程是将食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

从凯氏定氮法原理不难看出这种方法检测的是食品总氮的含量，如果人为加入含氮（或氨基）的化学品，这种方法是无法区别的。将化学品中含氮量直接折算成了蛋白质含量，从而达到了人为提高蛋白质含量目的。

目前为止已经被曝光的用于牛奶或其他食品掺假的化学品有：

甘氨酸 C₂H₅NO₂，含氮量18.7％。

尿素，CO(NH₂)₂，含氮量46％。

三聚氰胺，分子式C₃N₃(NH2)₃，含氮量66%。

凯氏定氮法无法区别此类富含氮的化合物，那么有没有别的蛋白质定量方法可以识别此类“假蛋白”，准确测量食品中的蛋白质含量呢？

目前常用的蛋白质定量方法除凯氏定氮法外还有有以下五种：

紫外吸收法：蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

优点：简便、灵敏、快速。对低浓度的盐，如 (NH₄)₂SO₄等及大多数缓冲液有一定的抗干扰能力。

缺点：测定准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，故测定样品时的要统一pH。

双缩脲法（Biuret法）：双缩脲（NH₃CONHCONH₃）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1～10mg蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

Folin－酚试剂法（Lowry法）：以最早期的双缩脲法为基础，并有所改进。蛋白质与Cu²⁺ 反应，产生蓝色的反应物。但是与双缩脲法相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA、Triton x-100、(NH₄)₂SO₄等物质的蛋白不适合此种方法。

考马斯亮蓝法（Bradford 法）：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰为595nm。其最大的特点是敏感度好，是Lowry 和BCA 两种测试方法的2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰Lowry、BCA 反应的还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。

缺点：使用不同蛋白质的标准品会导致同一蛋白样品的定量结果差异较大。

考马斯亮蓝法示意图

BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu²⁺ 反应产生Cu，后者与BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于Lowry法，操作简单，敏感度高。但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。

BCA法示意图

从以上各种蛋白质测定方法的比较不难发现，考马斯亮蓝法（Bradford 法）、BCA（Bicinchoninine acid assay）法由于其反应原理是反应物与蛋白质直接作用，对铵盐类等含氮化合物的抗干扰能力较强，可作为凯氏定氮法检测蛋白质含量时的补充验证手段。

使用化工原料搀入食品以达到提高蛋白质含量的作假手段，很大程度上是针对某种特定的检测手段如凯氏定氮法。只要明确了一种分析手段，就会找到相应的干扰物质用于提高蛋白质含量的检测值。

因此，在复杂混合物蛋白质含量检测上，应该首先通过实验验证，确定几个可用的检测手段，在实际应用中，做到几个检测手段联合应用，相互参照，将大大提高蛋白质测定的准确性。

在食品中添加化工原料是一种性质非常恶劣的犯罪行径，我们姑且认为大多数有良知的商家不会做这种伤天害理的事情。最近几年，媒体还曝光过使用植物蛋白替代动物蛋白，还有的添加人工蛋白：即用各种来源的水解蛋白代替食品中的天然蛋白质。这种用其他蛋白质替代天然蛋白，提高产品蛋白质含量的的方法，单纯采用上述蛋白质含量检测手段是很难区分的。从营养学的角度讲，在食品中添加其他蛋白质以改善食品的营养价值，是可取而且应该鼓励的。但这种改善必须有严格的科学依据，而不是单纯提高总蛋白质含量的检测值以达到某些食品标准的要求。

我们在进行目标蛋白质分析的时候，一般采用HPLC或电泳方法将不同的蛋白质分离开来，并进一步确定目标蛋白质的含量。将为了区分食品中是否添加了非标称来源的蛋白质，从技术角度讲，可以通过类似的方法建立指纹图谱进行区分。不同来源的蛋白质种类与含量不同，通过确定主要蛋白质的存在与含量及相互之间的比例，可以确定这些蛋白质的来源。蛋白质混合物可以通过HPLC、MS、2D等手段进行分离，从而进一步分析其主要组分的含量与相互之间的比例，从而建立某种食品如奶制品中的主要蛋白质成分指标。

如果说这些分析手段存在较大的技术困难，还有一种比较简单的方法来大概的确定其成分。我们知道，人食用蛋白质后，这些蛋白质经过消化最终变成氨基酸进入人体（未经消化的蛋白质直接吸收的可能性非常小）。因此蛋白质的营养价值其本质上是其组成氨基酸的营养价值。而不同来源的蛋白质氨基酸比例与含量会有差异，通过将蛋白质彻底水解，并分析这些氨基酸的组成与相互之间的比例，可以区分牛奶中是否添加了其他来源的蛋白质。如果真的有人作假手段高明到氨基酸组成与天然来源的一致，单就蛋白质的营养价值上来说，也可以具有与天然产品具有类似的营养价值了。

综合来说，任何存在的检测手段都可能有相应的干扰手段来作弊，但通过建立相对完备的检测手段，可以增加作弊的难度并提高作弊的成本，当作弊成本超过其收益的时候，也就没有人作弊了。

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